Pembuahan in vitro

PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang

Istilah Bioteknologi untuk pertama kalinya di kemukakan oleh Karl Ereky, seorang insinyur Hongaria pada Tahun 1917. Bioteknologi tidak hanya berkembang pada akhir – akhir ini saja, bioteknologi telah dimanfaatkan sejak ribuan tahun yang lalu di segala bidang seperti industri pangan, obat – obatan, pertanian, kesehatan, dan pengelolaan di lingkungan, di masa lalu bioteknologi dilakukan secara sederhana. Perkembangan yang pesat baru terjadi setelah diketahui mikroorganisme melakukan fermentasi yang di plopori oleh Louis Pasteur sehingga beliau mendapat julukan sebagai bapak bioteknologi.

Bioteknologi dalam bidang pertanian

1.      Penanaman secara hidroponik

Hidroponik merupakan pengerjaan air atau bekerja dengan air. Dalam praktiknya hidroponik dilakukan dengan berbagai metode, tergantung media yang digunakan.

2.      Penanaman secara Aeroponik

Aeroponik adalah pemberdayaan udara. Sebenarnya aeroponik merupakan tipe hidroponik atau memberdayakan air, karna air yang berisi larutan unsur hara disemburkan dalam bentuk kabut hingga mengenai akar tanaman.

In Vitro mengacu pada studi di biologi eksperimental yang dilakukan menggunakan komponen dari organisme yang telah diisolasi dari konteks yang biasa biologis mereka untuk membuat analisa yang lebih rinci atau lebih nyaman daripada yang dapat dilakukan dengan organisme keseluruhan, biasa disebut sebagai “percobaan tabung reaksi”. Percobaan In vitro meliputi:

a.       Sel Berasal dari organisme multiseluler (kultur sel atau kultur jaringan)

b.      Komponen subseluler (misalnya mitokondria atau ribosom)

c.       Ekstrak seluler atau subbseluler (misalnya gandum atau retikulosit ekstrak)

d.      Molekul dimurnikan dalam tabung tes (protein, DNA atau RNA)

Contoh dalam pekerjaan vitro

-          Polymerase chain reaction adalah metode untuk replikasi secara selektif dan spesifik dan urutan RNA dalam tabung tes.

-          Pemurnian protein melibatkan isolasi protein tertentu yang menarik dari campuran kompleks dari protein, sering diperoleh dari sel atau jaringan homogen.

-          In Vitro fertilisasi digunakan untuk memungkinkan spermatozoa untuk membuahi telur dalam wadah budaya sebelum menanamkan embrio yang dihasilkan.

-          In Vitro diagnostik mengacu pada berbagai tes laboratorium medis untuk mendiagnosa penyakit.

B.     Tujuan

-         Untuk mengetahui pengertian dan proses Pembuahan In Vitro pada Tanaman.

PEMBUAHAN IN VITRO

A.    Penyerbukan

Penyerbukan didefinisikan sebagai peristiwa pemindahan atau jatuhnya pollen dari anther pada kepala putik (stigma) baik pada bunga yang sama atau bunga lain yang masih dalam satu spesies. Jika pollen sesuai (compatible), pollen akan berkecambah pada kepala putik dan membentuk sebuah tabung pollen yang akan membawa gamet jantan pada gametofit betina. Suatu senyawa protein tertentu pada awal pembentukan pollen yang disebut Lectin, terdapat di dalan exine dan intine. Lectin berperan penting dalam mekanisme mengenali antara putik-pollen. Namun bila pollen tidak sesui (incompatible), perkecambahan pollen akan terhambat atau pertumbuhan tabung pollen akan tertahan dalam jaringan pemindah. Ketidaksesuaian dapat diwujudkan dalam jaringan baik kepala putik maupun stylus pada berbagai fase sebelum pembuahan (fertilisasi). Karena adanya ketidaksesuaian antara pollen dan stigma maka pekerjaan pemuliaan tanaman adalah mengatasinya agar tetap bisa berlangsung fertilisasi, dengan mengembangkan beberapa metode, antara lain:

1) Polinasi kuncup

2) Polinasi tertunda

3) Polinasi invitro

4) Polinasi intra ovari

Pemanjangan tabung pollen adalah tetap untuk setiap spesies. Ketika butir pollen siap dipencarkan, pollen ini dalam keadaan dormansi dengan kadar air antara 10-15% hampir mirip dengan biji. Pada Gramineae mempunyai umur pollen yang relatif pendek, misalnya pollen Paspalpum akan kehilangan viabilitasnya setelah 30 menit. Kebanyakan pada tanaman berbunga pollen akan mengalami penurunan secara drastis setelah 12 jam mengalami dehiscence. Namun viabilitas pollen dapat diperpanjang dalam keadaan artifisial yaitu bila disimpan pada temperatur dan kelembaban yang rendah.

Pollen akan segera berkecambah setelah beberapa menit dilepas oleh anther, bila ketersediaan dari air, garam anorganik tertentu, termasuk boron dan sumber energi seperti sukrose cukup. Tabung pollen akan masuk ke dalam stigma melalui diantara sel-sel jaringan pemindah di dalam stylus dan akhirnya mencapai ovul. Waktu yang diperlukan pollen untuk mencapai ovul antara 12-24 jam. Waktu yang digunakan untuk proses tersebut setiap spesies tidak sama, seperti pada Taraxacum diperlukan 15 menit sedangkan pada pohon Quercus memerlukan waktu 14 bulan.

B.     Pembuahan

Pembentukan buah dimulai dengan adanya proses penyerbukan yang meliputi pengangkutan polen dari benang sari (stamen) ke putik (pistillum) dan jatuhnya butir-butir polen di atas kepala putik (stigma). Selanjutnya, polen akan berkecambah dan membentuk tabung polen untuk mencapai bakal biji (ovule). Peristiwa bertemunya polen (sel jantan) dengan bakal biji (sel telur) di dalam bakal buah (ovary) disebut pembuahan (fertilisasi).

Kepala putik yang telah masak biasanya mengeluarkan lendir yang mengandung larutan gula dan zat yang diperlukan untuk perkecambahan polen. Polen yang normal akan berkecambah dengan terlebih dahulu menyerap air dan zat – zat lain yang terdapat pada media, kemudian polen akan mengembung, sehingga pori pada polen akan pecah dan mengakibatkan polen berkecambah. Butir polen akan membelah secara mitosis menjadi dua buah inti yaitu inti vegetatif (tube nucleus) dan inti generatif (inti sperma). Pada saat mulai berkecambah inti generatif membelah diri menjadi dua inti sperma, sehingga dalam tabung polen terdapat dua buah inti sperma (sperm nuclei) dan satu inti vegetatif. Pertumbuhan tabung polen seluruhnya diatur oleh inti vegetatif, sedangkan kedua inti sperma bertugas untuk melakukan pembuahan di dalam bakal biji. Polen yang berkecambah di atas kepala putik akan tumbuh memanjang ke bawah dan masuk ke dalam saluran tangkai putik (canalis stylinus) menuju ruang bakal buah (ovarium) sampai ujungnya dapat menyentuh kantung embrio (saccus embryonalis). Dengan demikian, tabung polen harus lebih panjang daripada tangkai putik. Pada umumnya pertumbuhan tabung polen pada saluran tangkai putik berjalan lambat. Untuk mencapai ruang bakal buah biasanya diperlukan waktu antara 5 – 60 jam dan kadang-kadang mencapai lima hari atau lebih (Darjanto dan Satifah, 1990).

Gambar. Proses Pembuahan pada Spesies Tanaman Angiospermae; a) Sel Induk Kandung Embrio Berisi Satu Inti, b) Pembelahan 1x Menghasilkan Dua Inti, c) Pembelahan 2x Menghasilkan 4 Inti, d) Tiga Inti Mati dan Sisa Satu Inti, e) Subuah Inti yang Hidup akan Membelah Diri, f) Pembelahan 1x Menghasilkan 2 Inti, g) Pembelahan 2x Menghasilkan 4 Inti, h) Pembelahan 3 Inti Menghasilkan 8 Inti, i) Delapan Inti Mengatur Diri menjadi Tiga Kelompok, j) Dua Inti Sperma dari Polen akan Melakukan Pembuahan, k) Peristiwa Pembuahan, l) Pembentukan Embrio (em) dan Endosperm (end), m) Biji yang Memiliki Embrio (em), Endosperm (end) dan Nucellus (nu) (Darjanto dan Satifah, 1990).

Gagalnya pembuahan disebabkan oleh polen dan sel telur yang mandul atau polen tidak cocok bergabung dengan sel telur. Dalam pembuahan, disamping polen dan inti sel telur harus sehat dan subur, polen juga harus mempunyai daya tumbuh atau kecepatan tumbuh tabung polen yang tinggi (Darjanto dan Satifah, 1990).

Faktor luar yang dapat menghambat penyerbukan dan pembuahan, diantaranya:

1. tidak adanya perantara untuk melakukan penyerbukan (angin, serangga, air, manusia),

2. hujan lebat yang dapat mengakibatkan butiran polen berlekatan dan menjadi gumpalan yang berat sehingga sulit untuk meninggalkan antera, bahkan akan mengakibatkan polen berkecambah, jika cuaca berubah menjadi panas maka polen tersebut akan mengering dan kehilangan daya tumbuhnya, disamping itu bunga yang basah merupakan sarang penyakit dan akan mudah busuk,

3. polen yang melakukan penyerbukan mempunyai mutu rendah (rusak, mandul) atau kepala putik cacat dan tidak sehat (Darjanto dan Satifah, 1990).

Pada tumbuhan Angiospermae, dua gamet jantan dibawa oleh tabung pollen untuk terjadinya proses fertilisasi. Satu gamet akan melebur dengan inti telur membentuk embrio dan yang lain melebur dengan dua inti kutub membentuk endosperm. Proses ini dikenal sebagai pembuahan ganda. Persilangan sexual suatu cara yang potensial untuk memproduksi tanaman yang superior dengan mengkombinasikan sifat-sifat dalam individu yang berbeda atau spesies atau bahkan genera yang berbeda. Persilangan antar spesies atau takson di atasnya dapat dilakukan dengan salah satu teknik seperti artifisial polinasi dari induk betina dengan pollen dari induk jantan terseleksi.

Tujuan utama program pemuliaan tanaman sampai saat ini adalah untuk meningkatkan hasil (produktivitas) tanaman melalui perbaikan karakter-karakter tanaman dalam kondisi lingkungan pertanaman yang normal maupun cekaman lingkungan. Untuk mencapai tujuan di atas, pemulia menempuh langkah-langkah seleksi populasi, penggabungan karakter yang diinginkan melalui persilangan, perluasan variasi genetik melalui mutasi (bila karakter yang diinginkan tidak ada di alam), atau penyisipan gen untuk memproduksi tanaman transgenik. Langkah-langkah pemuliaan tersebut dapat ditempuh melalui persilangan konvensional maupun modern.

Pemuliaan tanaman secara konvensional telah menghasilkan banyak sekali varietas-varietas unggul, namun juga menghadapi berbagai kendala seperti waktu produksi yang panjang, adanya inkompatibilitas yang sering menyebabkan kegagalan persilangan serta adanya mekanisme dari tanaman sendiri (umumnya pada Angiospermae) untuk mencegah terjadinya self-pollination.

Kendala dalam persilangan

Kendala yang sering dihadapi dalam persilangan dalam pemindahan pollen viable dari satu induk ke stigma lain penerima tidak selalu dapat membentuk biji, antara lain disebabkan:

1. Sebelum pembuahan atau sebelum pembentukan zigot (prefertilization atau prezygotic)

a. Incompatibility antara serbuk sari dengan putik sehingga menghambat terjadinya pembuahan

b. Terhambatnya perkecambahan pollen atau tabung pollen gagal mencapai ovul yang disebabkan stylus terlalu panjang atau pertumbuhan tabung pollen yang terlalu pelan sehingga tabung pollen baru mencapai dasar stylus sebelum bengkak (abcises)

c. Tabung pollen pecah di dalam stylus

d. Biochemical incompatibility, yaitu tangkai putik mengeluarkan senyawa kimia tertentu sehingga pollen yang telah berkecambah tadi tidak bisa menembus tangkai putik (stylus) sehingga perkembangan tabung pollen terhenti sampai stylus

e. Pertumbuhan tabung serbuk sari hanya mencapai microphyl.

2. Setelah terjadi pembuahan (post fertilization)

a. Terjadi fusi pada inti-inti gametnya sehingga mencegah pembuahan

b. Pembuahan terjadi tetapi embrio hibrid gagal berkembang hingga masak disebabkan adanya ketidaksesuaian antara embrio-endosperm atau pertumbuhan endosperm sangat miskin

c. Setelah terjadi pembuahan, perkembangan embryo terhambat

d. Tidak terbentuk endosperm yang memadai

e. Biji yang terbentuk terganggu proses penuaannya

f. Biji yang dihasilkan viabilitasnya rendah (menghambat perkecambahan)

Kendala-kendala di atas seringkali menyebabkan kegagalan produksi hibrida. Kendala yang terjadi setelah pembuahan dapat diatasi dengan perkecambahan embrio (embryo culture dan embryo rescue) sedangkan kendala sebelum pembuahan dapat diatasi dengan salah satu teknik kultur jaringan yaitu Invitro pollination atau pembuahan secara invitro

C.     Pembuahan Invitro

pembuahan ini dilakukan untuk mengatasi dua macam inkompatibilitas, yaitu :

·         Inkompatibilitas yang disebabkan oleh silangan antar spesies atau antar genera. Untuk silangan antar genera lebih baik dengan fusi protoplast.

·         Inkompatibilitas yang disebabkan kegaggalan untuk menyerbuk sendiri bagi tanaman yang secara alamiah hanya dapat menyerbuk silang. Tujuan utama adalah untuk mendapatkan segregan yang baru.

Selain untuk mengatasi inkompatibilitas, pembuahan tabung dipergunakan mengekstrak haploid secara partogenesis. Contoh pada penyilangan Hoerdeum vulgar x H. bulbosum. Dan Himulus lutens x Terenia Fournieri (pierek, 1978)

D.    Prosedur Pembuahan Invitro

Prosedur pembuahan invitro pada Tembakau (Nicotiana tabaccum) adalah sebagai berikut:

1.      Pengumpulan pollen

2.      Pengujian viabilitas pollen

3.      Pembuahan in-vitro, ada dua teknik yaitu:

a.       Stigma fertilization

b.      Placenta fertilization

1. Pengumpulan/koleksi pollen (serbuk sari)

Tahapan pertumbuhan pollen sangat menentukan keberhasilan pembuahan, oleh karena itu harus dipilih benang sari yang telah berkembang penuh dan siap membuka (sesaat sebelum pollen disebarkan oleh benang sari). Benang sari ini disterilkan lalu didalam laminar air flow pollen tersebut dikumpulkan ke atas gelas mikroskop.

2.      Test viabilitas pollen

Viabilitas pollen dapat diukur dengan cara menguji sebagian kecil pollen yang telah dikumpulkan. Caranya adalah mengkulturkan/ mengecambahkan pollen tadi ke dalam media yang mengandung sucrose (10%), boric acid (0,01%), CaCl2.2H2O dan agar (0,75%). Obseervasi dilakukan dibawah mikroskop terhadap perkecambahan pollen.

3.      Penyerbukan invitro

Secara terminologi penyerbukan invitro dibedakan menjadi 3 metode, yaitu:

a)      Penyerbukan kepala putik (stigma pollination)

Yaitu teknik penyerbukan dengan cara menaburkan serbuk sari langsung ke atas tangkai putik (stylus) dengan cara terlebih dahulu memotong kepala putiknya (stigma). Putik yang tidak memiliki stigma ini terlebih dahulu dikulturkan dalam botol kultur dengan media yang sesuai.

b)      Penyerbukan plasenta (placental pollination)

Yaitu teknik penyerbukan dengan cara menaburkan serbuk sari (pollen) langsung ke atas placenta (tali pusat) yang terdapat dalam badan buah (ovule) dengan cara terlebih dahulu memotong badan buah pada pistil sampai ovule sehingga placentanya terlihat, bagian ini dikulturkan dalam botol kultur baru kemudian dilakukan penyerbukan dengan meletakkan pollen langsung di atas placenta.

c)      Penyerbukan bakal biji (ovular pollination)

Yaitu penyerbukan secara artifisial dengan cara menaburkan pollen langsung pada bakal biji (ovule) dengan cara mengeluarkan ovule dari ovarium (bakal buah) terlebih dahulu.

Keberhasilan dari teknik polinasi invitro sangat tergantung pada:

1.      Eksplan butir pollen dan ovul pada fase perkembangan yang tepat

2.      Pemilihan media yang tepat yang dapat memacu perkecambahan tabung pollen dan perkecambahan embrio.

Beberapa aspek biologi pembungaan harus dikuasai, seperti:

1.      Anthesis

2.      Dehiscence anther

3.      Polinasi

4.      Perkecambahan pollen

5.      Pertumbuhan tabung pollen

6.      Penetrasi ovul

7.      Fertilisasi

8.      Perkembangan embrio dan endosperm.

E.     Aplikasi Fertilisasi Invitro

Teknik ini mempunyai manfaat untuk pemuliaan tanaman, antara lain seperti:

1.      Produksi hibrid dari hasil silangan antar spesies, antar genera, antar
familia, ordo, classis ataupun divisio

2.      Induksi tanaman haploid yang dapat dihasilkan dengan cara: polinasi
tertunda, hibridisasi berjarak (hibrid antar spesies yang berbeda), polinasi
dengan pollen abortif atau pollen yang telah diradiasi dan induksi haploid
pada ovary dengan perlakuan fisik atau kimiawi

3.      Mengatasi ketidaksesuaian sexual self

4.      Untuk mempelajari fisiologi pollen dan fertilisasi.

Hal-hal yang mendukung keberhasilan fertilisasi invitro untuk
menghasilkan biji yang viable, antara lain adalah:

a.       Umur eksplan terutama ovul

b.      Perkecambahan pollen cukup

c.       Tabung pollen dan gametogenesis pada pertumbuhan yang tepat

d.      Tabung pollen dapat masuk ke dalam ovul

e.       Derajat fertilisasi

f.       Penambahan casein hydrolysate 500 mg/l pada beberapa kasus dapat memacu pembentukan biji yang viable.

KESIMPULAN

pembuahan ini dilakukan untuk mengatasi dua macam inkompatibilitas, yaitu :

·         Inkompatibilitas yang disebabkan oleh silangan antar spesies atau antar genera. Untuk silangan antar genera lebih baik dengan fusi protoplast.

·         Inkompatibilitas yang disebabkan kegaggalan untuk menyerbuk sendiri bagi tanaman yang secara alamiah hanya dapat menyerbuk silang. Tujuan utama adalah untuk mendapatkan segregan yang baru.

·         Selain untuk mengatasi inkompatibilitas, pembuahan tabung dipergunakan mengekstrak haploid secara partogenesis. Contoh pada penyilangan Hoerdeum vulgar x H. bulbosum. Dan Himulus lutens x Terenia Fournieri (pierek, 1978)

·         Prosedur pembuahan invitro pada Nicotiana tabaccum adalah Pengumpulan pollen, Pengujian viabilitas pollen, Penyerbukan in-vitro.

DAFTAR PUSTAKA

Jurnal Studi Perkecambahan Polen Pepaya Secara In Vitro, oleh Cenra Intan Hartuti Tuharea. Institut Pertanian Bogor.2009

Burke, J. J, J. Velten and M. J. Oliver. 2004. In vitro analysis of cotton pollen germination. Agron. J. 96:359-368.

Buyyukkartal, H. N. 2003. In vitro pollen germination and pollen tube characteristics in tetraploid Red Clover (Trifolium pratense L.). Turk. J. Bot. 27:57-61.

http://adhekpeicesh14.blogspot.com/2010/12/pembudidayaan-tanaman-dengan-teknik.html